25-羟基维生素D3（骨化二醇）的生物催化生产相较于传统化学合成具有显著优势，但已报道的维生素D3羟化酶普遍存在催化效率不足的问题，限制了其实际应用。本研究从二氧杂环己烷假诺卡氏菌CB1190中鉴定出一种细胞色素P450酶CYP107Pdh，该酶对维生素D3具有独特的C26位羟基化活性。通过结构导向的环区工程联合底物结合口袋重塑改造，成功构建了五重突变体89_90insIP/T112A/V161L/G186V（M4），其区域选择性从野生型的91%C26羟基化转变为81%C25羟基化（骨化二醇产物）。该突变体催化效率（kcat/Km）较野生型提升75倍，活性显著增强。(湖北研科情报局）计算分析表明，这种区域选择性转变与活性提升主要源于底物结合口袋构象从开放态向闭合态的转变，从而优化了底物结合并促进维生素D3的25位高效羟基化。最终，通过半制备规模的生物转化，在1升反应体系中获得2.64克高纯度结晶骨化二醇（纯度95%），不仅扩充了维生素D3羟化酶资源库，更为骨化二醇的工业化生产提供了可行方案。
然而，骨化二醇的传统化学合成方法面临重大挑战：其工艺步骤复杂、反应特异性低且收率不足25%，导致生产成本居高不下。相较之下，生物催化法生产骨化二醇展现出环保高效的优势。
总结本研究成功鉴定出一种具有C26位区域选择性的P450酶CYP107Pdh。通过结构导向的蛋白质工程策略，实现了从C26到C25位选择性的完全逆转，并显著提升了催化效率。具体而言，通过环区工程和底物结合口袋重塑，开发出的五重突变体M4（89_90insIP/T112A/V161L/G186V）将25(OH)VD3与26(OH)VD3的产物比例从野生型的9:91转变为81:9，骨化二醇产量达2.64 g/L，成为CYP107家族中最高效的VD3羟化酶。分子动力学模拟进一步阐明了P450Pdh M4选择性转变和活性提升的分子机制：底物结合口袋从开放态向闭合态的构象转变是关键因素。该研究不仅扩充了VD3羟基化酶资源库，也为改造其他P450酶生产高附加值化合物提供了重要指导。
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